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细胞治疗干货|免疫细胞杀伤经典案例
点击次数:701 发布日期:2019-7-8  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

 
在细胞治疗过程中,评价免疫细胞的增殖能力,以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA®  BrdU细胞增殖方法,凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势,已逐渐成为主流的检测技术。在此,通过以下一系列的应用案例,我们将向大家展示DELFIA® EuTDADELFIA®  BrdU活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。
 
一,CAR-T细胞杀伤
 
毫无疑问,CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国,中国多数CAR-T疗法已进入临床研究,并且产业化发展迅速,而美国则还集中在临床前研发[1]
 
 
安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外,CAR-T疗法还会诱发植物抗宿主反应 graft versus host disease GVHD)等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2],研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法,提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法,研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系,并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11(K562为敏感细胞对照,RS4;11为耐受细胞对照)[3]。
 
 
由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞,因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答(Recall response)。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU,研究确认CD45RA- T细胞对人CMVEpstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanus toxoid有更为显著的免疫反应(下图a,增殖指标)。基于同样的增殖检测平台,研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR),对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体,CD45RA+细胞MLR实验中具有更高的增殖能力(下图b)和IFN-γ分泌能力(下图c)[3]
 
 
进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台,在白血病小鼠模型的基础上,研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时,发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势,研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况,确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用,两周内强力抑制分分彩发光信号至检测限以下。最后,基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞,研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。
 

 
二,CAR-NK细胞杀伤
 
CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究,其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞,NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞,因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全,支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗,如博生吉的CD7 CAR-NK
 
6月份的Molecular Therapy期刊上,广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs,研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12,并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法,研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系,优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。
 

 
借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系,研究通过活体成像方法,在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少,强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。
 
 
三,T细胞杀伤
 
T细胞不仅是免疫系统的核心成员,也是适应性免疫反应的基石。因此,T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要,其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时,RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力,而48小时则没有这个现象。基于动物实验,研究推测多种细胞参与杀伤,包括CD8+,NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。
 
 
除了传统T细胞杀伤外,DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子,如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。
 
 
四,NK细胞杀伤
 
鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性,其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外,NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中,基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物(组合)研发,同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。
 
 
 
除了直接杀伤靶细胞外,抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中,DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出,除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外,IVIG几乎完全抑制ADCC活力(下图上)[8]。在该研究中,除了ADCC检测外,Perkinelmer的放射检测解决方案(3 [H]-ThymidineMicroBeta 2也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG,免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖(下图下),而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一,其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。
 
 
 
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参考资料:
 
[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z
[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul; 50(7): 968–977.
[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory response without graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb;29(2):387-95.
[4] Xiao L, et al.  Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5;27(6):1114-1125.
[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov;16(11):1329-39.
[6] Lewis SM, et al.  Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8.
[7] Ashizawa T, et al.  Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1;23(1):149-158.
[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27;10:556.
 [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC; https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ
 
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